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- 惜惜and有有 2017-05-20 00:00:00
- 一、活細胞成像系統原理 目前主流的活細胞成像系統從原理上可以分為兩大類: 基于寬場反卷積技術 基于共聚焦技術 兩種技術作為目前Z流行的活細胞成像技術,均可以實現在維持細胞存活的情況下,快速獲取單一焦平面的信號,在具體性能上則各有擅長。 寬場反卷積技術 對光線進行反卷積運算是光學成像領域的成熟技術,Z早由美國國家航空航天局開發并成為觀察微弱天體信號的標準技術。去卷積和共聚焦技術是光學顯微鏡領域獲得單一焦平面光線的兩大主流技術(J.M.Murray, live cell imaging, 2010)。通過將非焦平面的光線還原至焦平面上,大大提高了樣品信號的強度以及圖像的信噪比。由于去卷積技術設計到大量的后期運算,因此在高性能計算機發明以前,一直受制于運算能力,沒有得到大規模的推廣。隨著近年來計算機性能的大幅提升和價格的下降,去卷積技術逐漸成為光學顯微鏡的主流技術。一個點光源經過顯微鏡的光路,由于鏡片對光線的衍射和散射,Z終呈現在觀察者面前的是一個模糊的點,所以點光源變成模糊的點的過程即為卷積。反卷積就是把模糊的點還原成點光源的過程。 以API 公司的DeltaVision 系統為例,其反卷積過程經歷以下幾步: 1)首先通過無數的計算和實驗,得到點光源經過顯微鏡物鏡后變模糊的規律,建立模型。 2)選擇wan美的物鏡,保證樣品信號經過物鏡后變模糊的規律符合步驟一中得到的模型。 3)將通過顯微鏡光路的所有的光信號進行收集,因為點光源經過顯微鏡光路后會變成一個空間中的倒圓錐形,所以在收集信號的時候需要很準確的記錄信號的Z 軸信息。 4)對收集到的所有光信號按照步驟一中的模型進行還原,Z終將模糊的點還原成清晰的點,客觀反映它在空間的位置和強度。 目前去卷積技術越來越廣泛地應用于生物學圖像的研究中。 共聚焦技術 共聚焦顯微鏡它采用點光源(point lightsource) 照射標本,在焦平面上形成了一個輪廓分明的小的光點(light spot ) ,該點被照射后發出的熒光被物鏡收集,并沿原照射光路回送到探測器。探測器前方有一個針孔(pinhole) ,幾何尺寸可調。這樣,來自焦平面的光,可以會聚在探測針孔范圍之內,而其它來自焦平面上方或下方的散射光,都被擋在探測針孔之外而不能成象。光束掃描器又分為單光束、多光束或狹縫掃描器幾種。其中單光束掃描獲得的圖像質量Z好,狹縫掃描器雖然產生圖像的速率很高(可達實時水平) ,但其圖像信噪比低于單光束掃描,這是因為從狹縫長軸來的漫射光不能被有效遮擋。多光束掃描如碟片式共聚焦是由電動馬達驅動Nipkow 盤旋轉而實現的,其熒光量較低,速率一般較高。 寬場反卷積技術與共聚焦技術比較表 二、API 高分辨活細胞成像系統的主要特點 DeltaVision 活細胞成像系統有以下優勢: 1)高靈敏:得益于精密和GX的光路,以及lingxian的還原型反卷積技術,DeltaVision 將寬場顯微鏡的靈敏度和分辨率提高到新的水平,標準配置下Z低可以探測到13個GFP 分子,成為目前為止Z靈敏的光學顯微系統之一。 HIV 病毒通過DC 細胞和T 細胞的接觸侵染T 細胞,綠色顆粒為HIV 病毒 2)高速:標配下可達到 21 幀/秒(512×512)的成像速度。當配備EM-CCD 后,Z高可達到224 幀/秒(64×64),可用于囊泡運動和鈣火花等快速的生理生化過程觀察。 3)低光毒性:得益于靈敏度的顯著提高,即使微弱的熒光,也可以收集到足夠的信號,因此激發光的強度和時間可以大幅度減少。光損傷和光淬滅不再是活細胞和微弱熒光觀察的障礙。 4)智能:焦點漂移和細胞脫離視野是活細胞觀察的夢魘。DeltaVision 特有的自動對焦(autofocus)和細胞跟蹤(cell tracking)功能,不僅可以自動維持焦平面的穩定,而且能夠跟蹤移動的細胞,使這些問題迎刃而解,長時間連續的活細胞觀察不再困難。 通過對熒光信號和細胞輪廓的識別,DeltaVision 可以精確的跟蹤需要觀察的細胞。 5)免維護:整個系統無易損易耗部件,光源壽命在 5000 小時以上,可正常使用7-10年以上,無需更換光源和校準光路。。系統控制和圖形處理基于Linux 操作系統,更適合多線程控制和數據處理,不僅大幅度降低了數據處理時間,也避免了在數據傳輸過程中感染病毒的危險。人性化的softWoRX軟件簡單易用,一個對話框內即可完成所有的控制操作。 三、API 高分辨活細胞成像系統的主要功能與應用領域 1)多維成像 目前可以做到六維(XYZ 三維,時間,不同點,不同波長)成像。通過光學切片(optical section)技術,實現對樣品的3D 觀察,構建樣品的立體結構。 經過3D 重建的腫瘤細胞:A 為正面,B 為旋轉30 度后,C 為旋轉90 度后。 2)3D 還原型反卷積處理 顯微鏡的分辨率和圖像的對比度取決于物鏡收集的光學信息。顯微鏡光路中衍射和折射現象的存在,使得樣品信號的位置和強度都發生了變化,降低了系統的分辨率和圖像的質量。API 作為對圖像數據進行反卷積處理Z早的實踐者,將顯微鏡的硬件設計和后期軟件處理wan美的結合在一起,通過對光學信號的3D 還原型反卷積處理,大大提高了顯微鏡的靈敏度和分辨率。 原始圖像和經過3D 反卷積處理后圖像的對比:A,B 為處理前,C,D 為處理后。 經過反卷積處理后,信號的強度和圖像對比度得到很大提升。 3)延時攝影 通過軟件精確的控制,拍攝的時間間隔從數秒到數小時不等,在長時間拍攝下也不會造成熒光信號的淬滅。根據實驗需求的不同,無論單一層面還是3 維結構,都可以獲得良好的效果。 正在分裂的Hela 細胞,其中綠色標記微管蛋白,紅色標記染色體 4)高速離子成像 結合高速 CCD 和GX的光路,在512×512 像素下仍然可以實現21 幀/秒的成像速度。對于快速的離子濃度的變化,Z快可以50-100 幀/秒的速度獲取圖像。 細胞間鈣信號的傳遞。使用Fluo‐3 標記胞內的鈣離子,并給予熒光信號對鈣離子的強度進 5.熒光共定位分析 通過比較多個熒光通道的定位情況,即可知道他們在空間上和時間上的分布信息,進而得到相應的熒光信號是否存在相互作用、協同運動、定向運輸等。 體外重組的病毒顆粒侵染細胞,綠色標記病毒的殼蛋白,紅色標記病毒的RNA結合蛋白。病毒入侵前,由于病毒顆粒完整,綠色信號和紅色信號共定位。病毒入侵細胞后,脫掉表面的殼蛋白,綠色信號和紅色信號分離。 6)熒光共振能量轉移(FRET) DeltaVision 特制的活細胞濾片組保證CFP/YFP,GFP/mcherry(RFP)熒光強度的精確記錄,并進一步計算出蛋白對之間精確的能量轉移系數。 計算不同熒光通道熒光信號的強度,進一步可得到能量轉移系數。 主要應用領域: 1)細胞遷移與細胞骨架; 2)細胞分裂與細胞周期; 3)細胞信號轉導; 4)組織分化與發育; 5)囊泡和蛋白運輸; 6)生理學和神經科學; 7)鈣離子信號研究; 8)蛋白質與DNA 的相互作用; 9)宿主與病原體相互作用; 10)癌癥研究; 11)藥理研究; 12)生物物理研究。
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? 什么是活細胞成像?
活細胞成像(live cell imaging)統稱為捕捉活的、活動狀態的細胞圖像的技術,這些細胞圖像可以是單個靜態圖像,也可以是延時系列圖像。相應地,活細胞成像的應用可以分為兩大類:
? 細胞在自然狀態下的圖像記錄。
? 實時觀察和記錄細胞、組織或整個生物體的動態過程。
? 觀察分析活細胞時面臨的挑戰
? 在相對較短的時間內采集大量信息。
? 要保持細胞保存在可調節培養環境氣體濃度和溫度(在很多情況下)的培養室中。
? 激發光源會損害活細胞。
? 細胞焦面漂移,無法聚焦。
? 需要使用配備有軟件或硬件控制自動對焦的成像儀器來避免這種情況。
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- 干涉顯微鏡能看到活細胞嗎
干涉顯微鏡能看到活細胞嗎?這一問題在生物學和細胞學研究中有著廣泛的關注。干涉顯微鏡作為一種先進的光學成像技術,其高分辨率和非侵入性特點使其在生物學、醫學和材料科學等領域得到廣泛應用。本文將探討干涉顯微鏡在觀察活細胞方面的能力,分析其工作原理、優點與局限性,并討論該技術在細胞生物學研究中的實際應用。通過對這一問題的深度解析,讀者將對干涉顯微鏡在活細胞觀察中的應用有更清晰的理解。
什么是干涉顯微鏡?
干涉顯微鏡是一種通過干涉效應增強樣品對比度的顯微鏡。與傳統的光學顯微鏡不同,干涉顯微鏡利用相干光源生成干涉圖樣,從而能更清晰地呈現細胞結構及其動態過程。它能夠在不使用染料和標記物的情況下,通過相位對比增強細胞內細微結構的可視化效果。這種技術特別適合觀察生物樣品,尤其是活細胞,因為它不會對細胞造成損傷。
干涉顯微鏡對活細胞的觀察能力
干涉顯微鏡的優勢之一是能夠觀察到活細胞的微觀動態變化,而無需對細胞進行染色或其他干擾性處理。這使得研究者可以更真實地捕捉到細胞在不同生理狀態下的行為。例如,通過干涉顯微鏡,科學家可以觀察到活細胞內的細胞器、細胞分裂、細胞遷移等過程,而這些在傳統顯微鏡下很難清晰呈現。
干涉顯微鏡的分辨率通常可以達到納米級,能夠揭示細胞結構的細微變化,進一步提高了活細胞成像的精確性。這對于細胞生物學和醫學研究具有重要意義,尤其是在研究細胞疾病、細胞等領域時。
干涉顯微鏡的優勢與局限性
干涉顯微鏡在活細胞觀察中的一個主要優勢是其非侵入性。傳統的顯微鏡通常需要對細胞進行染色處理,這可能會影響細胞的正常生理活動。而干涉顯微鏡通過不接觸樣品的方式,能夠實時觀察細胞內的變化而不會對細胞造成直接影響。因此,這項技術成為了觀察活細胞、追蹤細胞動態過程的理想工具。
干涉顯微鏡也存在一定的局限性。由于其依賴于光波干涉的原理,這就要求顯微鏡系統的精度非常高,尤其是對光源的控制要求十分苛刻。干涉顯微鏡更適用于透明或半透明的樣品,對于不透明或高度復雜的樣本,其成像效果可能受到一定限制。干涉顯微鏡的操作和數據分析相對復雜,要求研究者具有一定的技術背景和經驗。
干涉顯微鏡在生物學研究中的應用
干涉顯微鏡在生命科學中有著廣泛的應用。例如,在癌癥研究中,研究者利用干涉顯微鏡觀察癌細胞的動態變化,探索其與正常細胞的差異。在神經科學中,干涉顯微鏡能夠幫助科學家實時觀察神經元的活動和突觸的變化,為研究大腦功能和疾病提供重要線索。該技術還被廣泛用于藥物篩選、細胞藥理學研究和臨床醫學檢測等領域。
結論
干涉顯微鏡在觀察活細胞方面具備巨大的潛力和優勢。它不僅能提供高分辨率的細胞圖像,而且不會對細胞產生任何干擾或損傷。盡管在操作上有一定的技術難度和局限性,但隨著技術的不斷發展和改進,干涉顯微鏡無疑將成為生命科學領域研究的核心工具之一。因此,干涉顯微鏡在活細胞觀察中的應用前景廣闊,值得繼續深入探索與應用。
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- 明美活細胞成像儀用于細胞挑選
在許多細胞生物學實驗室中,活細胞成像是一種理想的分析工具。現有的活細胞成像主要依賴昂貴的、難以操作的大型設備。而明美新研發的一款活細胞成像儀,小巧輕便,適合放在超凈工作臺。
活細胞成像儀是一臺適合小規模細胞培養的小巧輕便成像設備,它采用WiFi相機無線連接,可以適配電腦、手機、平板等多種終端設備,標配明場和相差兩種觀察方式,可選三通道LED熒光實現熒光觀察,可選電動XYZ三軸實現自動對焦,可選3個物鏡實現不同觀察需要。
活細胞成像儀作為智能活細胞動態成像監測設備,能夠幫助您優化日常細胞培養工作并將成像結果標準化,改善下游實驗流程。
活細胞成像儀可用于數據存儲和圖像分析,您可以在平板電腦實時地訪問實驗數據和查看細胞培養。
來源:https://www.mshot.com/article/1363.html
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細胞生物學是生命科學的一門學科。顧名思義,它致力于研究生物。單憑這一事實就足以成為研究細胞自然生存狀態的理由。當然,活細胞成像還有其他深層次的原因。在本篇文章中,我們列舉了用延時顯微鏡研究活細胞是有意義的五大很好的理由。
背景
活細胞成像允許在一定時間內在顯微鏡下對細胞進行體內觀察。各種顯微鏡技術適用于活細胞成像:例如,可以采用無標記的技術,如相差,DIC,或干涉測量法,也可以依靠熒光顯微鏡,利用熒光標記標記和可視化細胞亞結構、分子或蛋白質。當然,活細胞成像也面臨挑戰,在建立活細胞圖像實驗時需要考慮某些要求。最重要的是,必須確保顯微鏡配備了一個stage top 培養箱,能夠提供理想的環境,使細胞在一段時間內保持存活和健康。
圖1.A:活細胞成像過程中需要考慮和控制的環境參數
圖1.B:倒置顯微鏡的臺頂培養箱示意圖
參數和環境條件是此類實驗的重要部分,我們將在以后的公眾號中討論。如果您有興趣,可以在本篇文章中查看更多相關內容。在此我們已經介紹了基本知識,接下來我們將繼續深入探討為什么您應該使用活細胞成像來研究您的細胞:
1.避免固定過程中的人工制品
細胞通常在顯微鏡觀察前固定(如免疫熒光),以保存在逼真的狀態。多年來,許多不同的化學和物理程序已被優化和建立,以保持原始樣品的質量。然而,固定過程會對細胞造成損害(當然在這個過程之后,它們會死亡),并不可逆轉地改變其組織、結構和形態(細胞器收縮、蛋白質定位錯誤等)。然而,活細胞成像可以讓我們研究活細胞。這意味著他們應該展示他們的自然形態,這仍然會受到熒光標簽、激光等的影響,但這就像環境條件一樣,是一個不同的狀況。
2.觀察和分析動態過程
活細胞成像使我們能夠觀察整個細胞群、單個細胞甚至亞細胞水平的動態事件。當固定細胞將其鎖定在特定時間點的特定(行為或結構)狀態時,對活細胞的顯微鏡觀察可以洞察整個動態過程。基于功能性細胞的檢測,如損傷和遷移(圖2)或趨化實驗是活細胞成像應用的很好的例子。這些分析使得研究細胞對化學(趨化性)或機械(傷口愈合)刺激的反應成為可能。
圖2:使用ibidi Stage Top孵育系統的活細胞成像顯示了傷口愈合和遷移試驗中MCF7細胞的間隙閉合。相差;10倍物鏡。
3.實時跟蹤細胞變化
活細胞顯微鏡是實時了解細胞隨時空變化的一種有價值的方法,而不是依賴于固定細胞的端點的分析結果。通過使用延時視頻顯微鏡對細胞進行更長時間的跟蹤,可以捕捉到結構重排的動態(如圖3,感受趨化刺激后細胞骨架的極化), 或使用固定細胞可能會錯過的瞬時細胞性活動(如,有絲分裂期間的染色體分離)。
圖3:應用趨化梯度后,表達LifeAct的原代樹突狀小鼠細胞中肌動蛋白動力學的活細胞成像
4. 研究單分子動力學、定位和相互作用
先進熒光標記和成像技術的發展,如光脫色熒光恢復技術(FRAP)、熒光壽命成像顯微技術(FLIM)和熒光共振能量轉移技術(FRET),使活細胞成像過程中單分子定位、動力學和相互作用的觀察和分析成為可能。
FRAP可以測量活細胞內熒光標記分子和蛋白質的遷移率。FLIM通過測量附著的熒光團的壽命來提供有關細胞分子分布及其環境的信息。
利用FRET,人們可以通過檢測兩個分子在納米級相互接近時所附熒光團的相互作用來測量活細胞中兩個分子的直接相互作用。
5. 從單個實驗中獲取更多信息
總的來說,如果您進行活細胞成像,您可以從單個實驗中獲得比從固定細胞成像更多的信息。這是因為活細胞成像使人們能夠跟蹤分子動力學和動力學,并提供了您感興趣的一個更大、更全面的細胞過程圖像。
對固定樣本的分析通常只提供某個細胞性活動的快照,而跟蹤整個動態過程使人們能夠從單個實驗中測量更多參數,并得出更多不同的結論。
如您有興趣了解更多關于活細胞成像的知識,請關注我們公眾號活細胞成像應用相關內容。也可以向我們索要相關資料。
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