產品名稱：無內毒素質粒小量提取試劑盒

英文名稱：Endo-Free plasmid mini kit

包裝規格：

有效期：本產品在常溫(15-25℃) 干燥條件下可保存12個月。

產品原理和特點：

無內毒素質粒小量提取試劑盒使用無胍鹽質粒純化方法，最高可以獲得高純度的質粒50 μg，操作方便；過濾柱除去內毒素，使內毒素濃度<0.1 EU/μg；沒有鹽離子殘留，提高測序、連接、轉化和酶反應效率。

使用前準備事項：

1、使用本產品前，請務必仔細閱讀說明書；

2、EFW(70%乙醇)在S次使用前加入42 mL無水乙醇，混勻后使用；

3、Buffer RA在S次使用前加入RNase A，2-8℃保存。

4、檢查Buffer RB 有無沉淀。如有混濁現象，可在37 ℃水浴中加熱至澄清；

5、全部操作均在室溫進行，低溫離心不利于酶去除 RNA；

6、從步驟“10”起，使用新的無內毒素的槍頭轉移液體并小心操作，可避免引入新的內毒素污染物。

操作步驟：

1、取大腸桿菌過夜培養液 1~4 mL，12,000 rpm室溫離心 1 min，棄上清收集菌體。

2、向菌體中加入溶液 RA 200 μL，渦旋振蕩，充分混懸菌體。

*不要殘留菌塊，會影響質粒得率和純度。

3、加入溶液 RB 200 μL，立即溫和上下顛倒5-7次，使之充分混勻，室溫靜置3 min，形成透明溶液。

*不操作不可劇烈，以免震斷細菌基因組DNA；也不可超過5 min，以免破壞質粒完整性。

4、加入溶液 RC 200 μL，立即溫和地上下顛倒 5~7 次，使之充分混勻。加入100 μL無水乙醇，顛倒混勻。12,000 rpm室溫離心10 min。

5、將上清全部轉移至套有過濾柱的結合柱中。12,000 rpm 室溫離心 2 min，棄濾液。

6、將結合柱放回，向結合柱內加650 μL 80%乙醇（自備），12,000 rpm室溫離心1 min，棄濾液。

7、將結合柱放回，12,000 rpm室溫離2 min，除去結合柱內殘留液體。

8、將結合柱放入新的1.5mL離心管中，敞口室溫放置5~10 min 使乙醇充分揮發。

*殘留乙醇將嚴重影響 DNA 洗脫。

9、向結合中加200 μL Elution Buffer，室溫靜置2~3 min，12,000 rpm室溫離心1 min，棄掉結合柱。

*將Elution Buffer預熱至60 ℃左右，可以增加洗脫效率。

10、向洗脫液中加入Buffer RE 200  μL，顛倒混勻，室溫靜置5 min。

11、加入Buffer NE 140 μL，顛倒混勻，并移入Endo-free過濾柱中，靜置5~10 min。12,000 rpm室溫離心2 min，棄過濾柱。

*靜置5~10 min可使絮狀物分層，利于過濾。棄過濾柱前，確認無液體殘留，否則再次離心過濾。

12、向濾液中加入等體積的異丙醇（或者兩倍體積的無水乙醇，自備），顛倒混勻后室溫放置15 min，10,000 rpm離心15 min，棄上清。

13、加入500 μL EFW(70%乙醇)洗滌沉淀，12,000 rpm室溫離心5 min，棄上清。

14、重復步驟“13”，盡可能棄上清。

15、敞口放置 5~10 min，使乙醇揮發，用適量EFW溶解沉淀。

常見問題解析：

質粒得率低可能原因及解決辦法：

1、菌體未活化，生長效率低，菌量少，需要活化菌種；

2、屬于低拷貝質粒。增加菌液的量；

3、Buffer RB 裂解不充分。

質粒純度差可能原因：

1、未加入RNase A 或RNase A未4 ℃保存；

2、加入Buffer RB 劇烈震蕩，使得基因組斷裂；

3、加入Buffer RC 操作慢，形成微小沉淀，蛋白質無法被充分漂洗干凈；

4、OD260/OD280 比值一般在 1.8-2.0 之間，小于 1.8 可能有蛋白污染，大于 2.0 有部分降解或 RNA 污染。

同科生物簡介：成立于2007年，是一家集研發、生產、銷售和技術服務于一體專注于生命醫學和生物技術領域的高科技企業。主營業務有科研產品、診斷試劑、分子診斷和技術服務等，主要服務于科研機構、大專院校、醫院和工業等客戶。

生產科研：同科生物搭建多個研發與合作技術平臺（博士后實踐基地、院士工作站、同濟大學人才培養與產學研合作基地及生物研究中心等），為技術創新提供了堅實的基礎保障。擁有三類體外試劑生產中心、儀器生產中心、研發質檢實驗室等、廠房和實驗面積達8000多平米，儀器設備設施先進齊全（包括定量PCR儀、生物安全柜、核酸蛋白測定儀、高壓細胞破碎儀、FPLC等系列高端精密儀器設備）。

研發團隊：同科擁有一支由中科院院士為顧問，國家千人為首席科學家，以博士碩士為主體的高效的國際化研發團隊。研發人員專業涵蓋生物化學、分子生物學、臨床醫學、免疫學、藥物制劑、生物技術、遺傳學、微生物學、生物工程領域，關聯性較大，專業結構合理，且形成互補，在重大項目及關鍵技術上具備卓越的攻關能力。

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