產品描述

細胞培養是生命科學研究中常見的實驗。不像其它常用的實驗方法，細胞培養是一個動態的連續過程，細胞通常會對操作失誤或污染物有所反應，這些反應往往表現出不正常的細胞狀態或培養基外觀。如果受到支原體污染時，細胞形態較之無明顯變化，極易被忽視，往往直到污染非常嚴重時才能發現。受污染的細胞膜上可能有幾百個支原體，這些支原體競爭營養并釋放有毒的代謝產物，嚴重影響實驗結果。

研究表明，至少二十多種支原體能污染細胞，其中最常見的有：口腔支原體（M.orale）、精氨酸支原體（M.arginini）、豬鼻支原體（M.hyorhinis）、發酵支原體（M. fermentans）、人型支原體（M. hominis）、唾液支原體（M.salivarium）、肺支原體（M.pulmonis）和梨支原體（M.pirum）等。培養細胞的支原體污染率在4%-92%不等，其污染來源包括工作環境、操作者本身（一些支原體是人體的正常菌群）、培養基、血清、細胞交叉污染、實驗器材和用來制備細胞的原始組織或器官的污染。

確認細胞培養過程中出現問題的潛在原因是一項困難且耗時的任務，在細胞培養中，任何突然的變化都應該被懷疑，同時良好的試驗規范和定期檢測支原體污染也十分必要。支原體檢測的方法有很多種，如直接培養、DNA熒光染色、ELISA和PCR法等。

GMyc-PCR支原體檢測試劑盒主要采用PCR方法對各種生物材料（如細胞培養物、實驗動物分泌物、動物血清等）支原體感染的檢測。它綜合了幾個優勢：靈敏、特異、快速并且可以用直接用細胞培養上清液檢測。本制品通過PCR方法檢測培養細胞等生物材料中的支原體，所用引物為根據支原體16S-23S rRNA序列保守區域設計，只特異性擴增支原體DNA，檢出靈敏度與特異性均較高。PCR擴增及電泳分析只需數個小時，操作方便簡單。

產品組分

【注】：

1. 40601-C長期不用時，可-85~-65℃冷凍保存。
2. PCR反應極其靈敏，為防止假陽性，加樣時，最后加陽性對照。

運輸與保存方法

干冰運輸，-25~-15℃保存，有效期18個月。若較長時間不用，請避光保存。

實驗流程

此PCR反應為巢式PCR，第一輪PCR結束后，取其反應產物為第二輪PCR模板。根據兩輪PCR產物電泳條帶之有無及片段大小來分析結果（第一輪陽性對照PCR條帶大小為448bp、第二輪陽性對照PCR條帶大小為304bp）。細胞培養3-6天后，直接取其上清液進行PCR反應。為排除細胞培養基抑制PCR反應，陽性對照中需加入等量的細胞上清液。

第一輪PCR：

1. 充分融解GMyc-1st PCR Mix（40601-A），按下列表格配制反應液：

【注】：為防止Positive Control Template（40601-C）污染，請將實驗組和陰性對照組加完以后，最后再將Positive Control Template（40601-C）加入陽性對照組。

2. 按下列條件進行PCR反應：

94 ℃         5 min

94 ℃         30 s

58 ℃         30 s      30~35 cycles

72 ℃         30 s

72 ℃         7 min

第二輪PCR：

1. 充分融解PCR Mix，按下列表格配制反應液：

【注】: 第一輪PCR反應液需經1000倍稀釋后方可用于第二輪PCR模板。

2. 按下列條件進行PCR反應：

94 ℃         5 min

94 ℃         30 s

58 ℃         30 s     30~35 cycles

72 ℃         30 s

72 ℃         7 min

反應結束后，取7 μL 的PCR反應液（不需要加loading buffer）直接進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，確認PCR擴增產物。

【注】: 跑膠時不需要額外添加loading buffer，但需要額外加入染料，避免出現沒有條帶的情況。

推薦使用頻率