一、引言

二、陽離子脂質體介導真核細胞基因轉染的原理

三、實驗材料與方法

（一）實驗材料

1. 細胞系：選用常見的真核細胞系，如 HeLa 細胞（人宮頸癌細胞）、HEK293 細胞（人胚腎細胞）等，這些細胞系具有生長迅速、易于培養和轉染等特點，適合用于基因轉染研究。

2. 質粒構建：構建含有特定報告基因（如綠色熒光蛋白基因 GFP）的重組質粒，用于監測基因轉染效率。報告基因的表達產物易于檢測和定量，能夠直觀地反映轉染效果。

3. 陽離子脂質體試劑：購買商業化的陽離子脂質體試劑，如 Lipofectamine 系列等，并根據實驗需求自行制備陽離子脂質體，其主要成分包括陽離子脂質 DOTAP（1,2 - 二油酰基 - 3 - 三甲銨丙烷）和輔助脂質 DOPE（二油酰磷脂酰乙醇胺）等。

4. 培養基及血清：使用適合相應細胞系生長的培養基，如 DMEM（杜氏改良 Eagle 培養基）、RPMI - 1640 培養基等，并添加一定比例的胎牛血清（FBS）以提供細胞生長所需的營養物質和生長因子。

5. 其他試劑：包括用于細胞消化的胰蛋白酶 - EDTA 溶液、用于細胞固定和染色的多聚甲醛、用于檢測基因表達的熒光顯微鏡、流式細胞儀等。

（二）實驗方法

1. 細胞培養

• 將凍存的真核細胞系復蘇后，接種于培養瓶中，在 37°C、5% CO? 的培養箱中培養。待細胞生長至對數生長期時，進行傳代培養，以維持細胞的良好生長狀態。

• 在進行基因轉染實驗前，將細胞接種于 24 孔板或 6 孔板中，根據實驗設計確定接種密度，一般為每孔 1×10? - 5×10? 個細胞，培養 24 小時，使細胞貼壁生長并達到合適的密度。

2. 陽離子脂質體 - 核酸復合物的制備

• 按照陽離子脂質體試劑說明書，將適量的陽離子脂質體和重組質粒分別用無血清培養基稀釋，然后將兩者輕輕混合，室溫孵育 15 - 30 分鐘，使陽離子脂質體與核酸充分結合形成復合物。在制備復合物過程中，需要注意脂質體與核酸的比例（N/P 比），不同的 N/P 比可能會影響復合物的穩定性和轉染效率，通常在 2 - 10 之間進行優化。

3. 基因轉染操作

• 將培養板中的舊培養基輕輕吸出，用無血清培養基洗滌細胞一次，以去除殘留的血清，因為血清中的成分可能會干擾陽離子脂質體與細胞的相互作用。

• 將制備好的陽離子脂質體 - 核酸復合物加入到細胞培養孔中，輕輕晃動培養板，使復合物均勻分布在細胞表面。然后在 37°C、5% CO? 的培養箱中繼續培養 4 - 6 小時。

• 培養結束后，加入含有血清的完全培養基，繼續培養 24 - 48 小時，使外源基因在細胞內充分表達。

4. 基因轉染效率的檢測

• 熒光顯微鏡觀察：對于攜帶 GFP 等熒光報告基因的轉染實驗，可以在轉染后 24 - 48 小時，直接在熒光顯微鏡下觀察細胞的熒光強度和熒光細胞比例。綠色熒光越強、熒光細胞數量越多，則表明轉染效率越高。通過對不同實驗組的細胞熒光圖像進行采集和分析，可以直觀地比較不同轉染條件下的轉染效果。

• 流式細胞術分析：將轉染后的細胞消化收集，用 PBS 緩沖液洗滌細胞兩次，然后用流式細胞儀檢測細胞的熒光強度。流式細胞儀能夠對大量細胞進行快速檢測和分析，準確測定熒光陽性細胞的比例，從而定量評估基因轉染效率。同時，還可以通過流式細胞術對轉染細胞進行分選，進一步研究轉染成功的細胞群體的生物學特性。

• RT - PCR 和 Western blot 檢測：除了熒光檢測外，還可以采用 RT - PCR 和 Western blot 技術檢測外源基因在轉錄和翻譯水平的表達情況。RT - PCR 可以擴增外源基因的特定 mRNA 片段，通過比較不同實驗組中目的基因 mRNA 的相對含量，評估基因轉染后的轉錄效率。Western blot 則是利用特異性抗體檢測目的蛋白的表達水平，進一步驗證基因轉染后在蛋白質水平的表達效果。

四、結果與討論

（一）陽離子脂質體 - 核酸復合物的特性

（二）細胞培養條件對轉染效率的影響

1. 細胞密度：不同的細胞接種密度對基因轉染效率有顯著影響。當細胞密度過低時，細胞與陽離子脂質體 - 核酸復合物的接觸機會減少，轉染效率較低；而當細胞密度過高時，細胞生長狀態變差，也會降低轉染效率。實驗結果顯示，在 HeLa 細胞中，當接種密度為每孔 2×10? 個細胞時，轉染效率最高。

2. 血清含量：血清中的蛋白質等成分可能會與陽離子脂質體結合，影響其與核酸的結合以及與細胞的相互作用。研究發現，在轉染過程中，無血清培養基能夠提高轉染效率，但長時間的無血清培養可能會對細胞造成損傷。因此，采用在轉染時使用無血清培養基，轉染后一定時間再加入含血清培養基的方法，可以在保證細胞活力的同時提高轉染效率。

（三）陽離子脂質體組成和 N/P 比對轉染效率的影響

1. 陽離子脂質體組成：不同類型的陽離子脂質體對基因轉染效率有明顯差異。以 DOTAP/DOPE 為基礎的陽離子脂質體在多種真核細胞系中表現出較好的轉染效果。通過改變輔助脂質的種類和比例，可以進一步優化陽離子脂質體的性能。例如，添加適量的膽固醇可以提高脂質體的穩定性和膜融合能力，從而提高轉染效率。

2. N/P 比：N/P 比是影響陽離子脂質體 - 核酸復合物形成和轉染效率的關鍵因素。在較低的 N/P 比時，脂質體與核酸的結合不完全，復合物穩定性較差，轉染效率較低；隨著 N/P 比的增加，轉染效率逐漸升高，但當 N/P 比過高時，如超過 10，會導致細胞毒性增加，轉染效率反而下降。在 HEK293 細胞中，N/P 比為 5 時轉染效率最高，同時細胞毒性相對較低。

（四）轉染時間對轉染效率的影響

五、結論