自然界中的植物都會面臨各種病害的侵染。病害FZ更是農業生產中的重中之重。科學家們一直致力于用各種技術研究植物病害的發病機制和FZ方法。在近年的ZX研究中，新興的組學研究技術逐漸成為病害研究的熱點。在各種組學技術中，從直觀、無損、快速、簡便以及農業應用推廣上考慮，植物表型成像分析技術無疑是ZY的選擇之一。

PlantScreen植物表型成像分析系統及表型成像圖

傳統表型概念里以形態學指標為主。而現代植物表型成像分析技術已經不局限于形態學，其主要應用的成像技術如下，它們在植物病害研究分別反映植物的不同表型變化與生理過程：

技術類別	表型與生理過程	病害研究用途	常用參數指標
葉綠素熒光成像技術	植物光合能力、光合電子傳遞鏈、光系統熱耗散等光合生理過程	評估病害對光合系統損傷程度與機制；由于光系統對脅迫的敏感性，是病害早期預警的靈敏且常用技術之一	ZD光化學效率Fv/Fm、實際光化學效率QY、非光化學淬滅系數NPQ、熒光衰減率“活力指數”Rfd等
UV-MCF紫外激發多光譜熒光成像技術	植物在病斑及周邊區域合成大量黃酮、多酚類次生代謝物，以防御病害的擴散	通過測量次生代謝物熒光，評估病害的發生程度與植物防御機制的激活	次生代謝物熒光F440、F520；葉綠素熒光F690、F740
形態成像分析技術	株高、株寬、葉面積、生物量、生長動態、色彩變化等形態的影響	評估不同條件下對植物形態的影響乃增產效應	株高、葉面積及病斑面積、數字生物量等
多/高光譜（反射光譜）成像分析技術	通過反射光譜的變化定量反映植物活力、色素組成、光合作用、生化組成、氮素營養、水分含量等表型生理，對病害的影響進行間接測量。	病害對從健康程度、色素組成、營養狀況等方面的影響，同時也配合葉綠素熒光成像技術對病害抗性進行進一步驗證。	歸一化植被指數NDVI、光化學反射指數PRI、花青素反射指數ARI、胡蘿卜素反射指數CRI等
紅外熱成像技術	獲得植物表面溫度分布圖及溫度數據	通過葉片溫度反映由于病害導致的葉片氣孔導度變化、代謝紊亂等	平均溫度、溫度范圍、水脅迫指數I

植物病害的病原體有病毒、細菌、真菌。而植物種類又有模式植物、谷物、蔬菜、水果等。植物表型成像分析技術能夠應對這些不同的研究需求嗎？我們從具體的文獻案例里查找答案，本期主要介紹關于抗病毒基因、蔬菜水果的葉片細菌病害相關研究案例：

一、利用模式植物研究抗病毒基因

法國農業科學研究院（INRA）的Jean-Luc Gallois研究團隊一直致力于馬鈴薯y病毒組的抗病基因研究。這一病毒組中包括蕪菁花葉病毒(TuMV)、西瓜花葉病毒(WMV)、三葉草黃脈病毒(ClYVV)等重要的農作物病毒。這方面研究的難點在于如何直觀、定量地測量病毒在植物樣品上的分布與積累。FluorCam多光譜熒光成像技術的出現解決了這一難題。FluorCam多光譜熒光成像技術僅能進行了葉綠素熒光成像測量，也提供了關鍵的GFP標記病毒活體成像圖。GFP成像圖直觀地表現病毒量的差異，反映了不同基因功能對擬南芥病毒抗性的影響。同時，葉綠素熒光成像則反映病毒對光合系統的損傷，可以同步提供病害光合表型信息。

法國農業科學研究院利用FluorCam封閉式熒光成像系統，從2015年起發表了一系列相關文章，研究方向包括病毒的TOR信號調控、跨物種合成eIF4E1等位基因獲得病毒抗性、利用CRISPR-Cas9 base editing基因編輯技術模仿eIF4E自然多態性與病毒抗性的關系、擬南芥敲除eIF4E1獲得ClYVV抗性但又與TuMV的敏感性相關等。

雖然GFP活體成像技術一般不歸于植物表型成像技術中，但在病害研究中會經常利用帶GFP標記的病原體來定量分析感染面積與病毒積累量。FluorCam多光譜熒光成像技術的GFP活體成像功能也廣泛應用與其他病原體的指示測量。

左圖：GFP標記的丁香假單胞桿菌感染軟棗獼猴桃枝條（EcoTech生態實驗室提供）；右圖：堿性金屬蛋白酶對GFP標記的TMV處理效果（Qin，2019）

參考文獻：

1. Zafirov D, et al. 2021. When a knockout is an Achilles' heel: Resistance to one potyvirus species triggers hypersusceptibility to another one in Arabidopsis thaliana. Mol Plant Pathol. 22: 334–347

2. Bastet A, et al. 2019. Mimicking natural polymorphism in eIF4E by CRISPR‐Cas9 base editing is associated with resistance to potyviruses. Plant Biotechnology Journal 17: 1736–1750

3. Bastet A, et al. 2018. Trans-species synthetic gene design allows resistance pyramiding and broad-spectrum engineering of virus resistance in plants. Plant Biotechnology Journal: 1–13

4. Qin Y, et al. 2019. Purification and Characterization of a Secretory Alkaline Metalloprotease with Highly Potent Antiviral Activity from Serratia marcescens Strain S3. Journal of Agricultural and Food Chemistry 67(11): 3168-3178

二、病害快速無損檢測與抗性品種鑒定

對植物病害進行快速檢測與早期預警，無損快速的植物表型成像技術無疑是不二之選。但植物表型組的相關參數少有幾十項，哪一項才是靈敏和準確的呢？很多科學家都進行了相關的探索。

德國萊布尼茨蔬菜和觀賞植物研究所IGZ將剛發芽的生菜幼苗感染了立枯絲核菌（Rhizoctonia solani），之后使用多種表型成像分析技術測試了各種不同參數，試圖確定哪些技術的哪個參數能夠更靈敏地將感染病害的植株和未感染的植株區分開。

研究中進行成像分析的參數與所屬技術如下：

l 葉綠素熒光成像：Fo、Fp、Ft、Fv、ZD光化學效率Fv/Fm、熒光衰減比率Rfd、光合有效葉面積日相對生長速率A_abs和A_rel

l UV-MCF多光譜熒光成像：F440、F520、F690、F740及各個參數之間的比值

l 紅外熱成像：作物水脅迫指數I1、I2、I3、平均溫度、中值溫度、溫度范圍

l 反射光譜成像：R_NIR、R_RED、歸一化植被指數NDVI

成像技術的另一個優勢就是可以同時測量幾十株乃上百株幼苗樣品，通過配套軟件就能夠簡便地去除圖像中的背景，自動計算相應的參數。

更為方便的是，一臺加裝紅外熱成像模塊的FluorCam多光譜熒光成像系統就可以完成所有上述參數的測量與成像。

左圖：FluorCam及ZX型FluorCam-Pro多光譜熒光成像系統；中圖：反射光譜歸一化植被指數NDVI成像圖的背景分割；右圖：基于RGB真彩成像對熱成像圖進行背景分割

測試結果發現，感染病害的植株和未感染的植株之間，ZD光化學效率Fv/Fm、熒光衰減比率Rfd、歸一化植被指數NDVI、作物水脅迫指數I1、光合有效葉面積日相對生長速率A_rel、多光譜熒光F440、F520等參數都表現出顯著差異。通過進一步數據統計分析ZZ發現ZD光化學效率Fv/Fm、熒光衰減比率Rfd在本次實驗中的識別效果，誤差≤0.052。Fv/Fm＞0.73的生菜幼苗即可認為是健康的。Fv/Fm甚能夠在病害癥狀發生前即可檢測到病菌感染。研究者希望通過進一步工作，將這一發現應用于園藝和農業生產實踐，比如優良抗病蔬菜品種的選育、病害的早期發現與FZ等。

熒光衰減比率Rfd和ZD光化學效率Fv/Fm的邏輯回歸函數，概率1代表健康植株，概率0代表染病植株

浙江大學同時使用FluorCam熒光成像系統對柑橘黃龍病進行了檢測分析。研究者通過對健康葉片、感染黃龍病葉片和養分缺乏葉片進行葉綠素熒光成像分析，確定了黃龍病的熒光標志，即“光合指紋”，結合葉綠素熒光參數與成像圖，對葉片黃龍病取得了ZJ識別分類效果，準確率達到97%。

左：不同特征選擇法獲得的葉綠素熒光成像圖；右：實際測量中的FluorCam葉綠素熒光成像系統與柑橘葉片樣品

參考文獻：

1. Sandmann M, et al. 2018. The use of features from fluorescence, thermography and NDVI imaging to detect biotic stress in lettuce. Plant Disease 102: 1101-1107

2. Weng H, et al. 2020. Characterization and detection of leaf photosynthetic response to citrus Huanglongbing from cool to hot seasons in two orchards. Transactions of the ASABE 63(2): 501-512

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