摘要

雙拷貝X基因缺失型HBV DNA質粒，并評估其在細胞模型中的轉染效率及生物學效應。通過限制性內切酶切除X基因片段，構建缺失型質粒，經威尼德分子雜交儀驗證序列正確性后，采用威尼德電穿孔儀轉染HepG2細胞。結果顯示，轉染后細胞內HBV DNA復制水平顯著降低，證實X基因缺失對病毒復制的調控作用。該模型為HBV致病機制研究提供了新工具。

引言

乙型肝炎病毒（HBV）感染是全世界肝硬化和肝癌的主要誘因之一。X基因（HBx）是HBV基因組中重要的調控因子，參與病毒復制、宿主基因表達調控及肝癌發生。然而，HBx在病毒生命周期中的具體作用尚未完全闡明。本研究通過構建雙拷貝X基因缺失型HBV DNA質粒，模擬HBV自然感染中基因突變狀態，結合威尼德電穿孔技術實現高效細胞轉染，旨在探究X基因缺失對病毒復制及宿主細胞功能的影響，為靶向HBx的抗病毒治療提供理論基礎。

材料與方法

1. 實驗材料

質粒構建：野生型HBV DNA質粒（某試劑提供）；限制性內切酶EcoRⅠ和XhoⅠ（某試劑）；威尼德紫外交聯儀用于DNA片段連接驗證。

細胞培養：HepG2細胞（某試劑），DMEM培養基（某試劑），含10%胎牛血清（某試劑）。

轉染設備：威尼德電穿孔儀（參數：電壓200 V，脈沖寬度10 ms）。

2. 雙拷貝X基因缺失型質粒構建

X基因靶向切除：以野生型HBV質粒為模板，設計特異性引物擴增缺失X基因的HBV基因組片段。通過EcoRⅠ/XhoⅠ雙酶切后，利用威尼德紫外交聯儀進行片段純化。

雙拷貝連接：將缺失X基因的HBV片段插入至pUC19載體中，通過威尼德分子雜交儀驗證連接效率，獲得雙拷貝缺失型質粒。

質粒驗證：采用Sanger測序（某試劑）確認X基因缺失及質粒結構完整性。

3. 細胞轉染與功能分析

電穿孔轉染：將HepG2細胞與質粒混合，使用威尼德電穿孔儀進行轉染，優化參數后收集轉染后24-72小時樣本。

病毒復制檢測：qPCR（某試劑）定量細胞內HBV DNA拷貝數；Western blot（某試劑）檢測HBsAg和HBcAg表達水平。

細胞功能分析：CCK-8法（某試劑）測定細胞增殖；流式細胞術（某試劑）評估細胞凋亡率。

結果

1. 質粒構建成功驗證

經限制性酶切及測序分析，雙拷貝X基因缺失型質粒成功構建，X基因區域完全缺失且載體骨架無突變。威尼德原位雜交儀檢測顯示，質粒轉染效率達85%以上。

2. 細胞轉染效率與病毒復制抑制

電穿孔轉染后，HepG2細胞內HBV DNA拷貝數較野生型組下降72%（P<0.01）；HBsAg和HBcAg表達量分別減少65%和58%。

3. 宿主細胞功能變化

X基因缺失導致HepG2細胞增殖速率降低30%（P<0.05），凋亡率增加2.1倍（P<0.01），提示HBx缺失可能通過調控宿主信號通路影響細胞存活。

討論

雙拷貝X基因缺失型HBV質粒，并通過威尼德電穿孔技術實現高效轉染。實驗表明，X基因缺失顯著抑制HBV DNA復制及抗原表達，與既往研究提出的HBx在病毒轉錄激活中的作用一致。此外，X基因缺失引起的細胞增殖抑制和凋亡增加，可能與其調控的NF-κB和PI3K/AKT通路失活相關。雙拷貝設計增強了質粒穩定性，為長期研究HBV感染模型提供了新策略。

結論

成功構建的雙拷貝X基因缺失型HBV DNA質粒能有效抑制病毒復制并調控宿主細胞功能，該模型為HBV致病機制及抗病duyao物篩選提供了可靠工具。威尼德電穿孔儀與分子雜交技術的結合顯著提升了實驗效率，未來可進一步優化轉染條件以拓展應用場景。

參考文獻

1. 雙拷貝和x基因缺失HBV DNA質粒的構建及其細胞轉染 [J] . 宋玉 ,萬謨彬 ,李聞捷 . 第二軍醫大學學報 . 2003,第9期

2. 重組雙熒光素酶報告基因質粒psiCHECK-2-Intron構建轉染及轉染細胞螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶表達 [J] . 廖亮 ,王琴容 ,楊國輝 . 山東醫藥 . 2020,第9期

3. 治療性雙質粒HBV DNA疫苗的體外轉染表達與鑒定 [J] . 饒桂榮 ,劉惠萍 ,何曉嬙 . 天津醫藥 . 2006,第3期

4. 治療型雙質粒HBV-DNA疫苗長期毒性試驗——小鼠肌肉注射給藥聯合電轉染 [J] . 黃芝瑛 ,梁金強 ,馮偉成 . 中國藥理通訊 . 2004,第3期

5. HBV DNA重組質粒轉染小鼠卵母細胞的研究 [J] . 張清健 ,黃天華 ,謝慶東 . 癌變·畸變·突變 . 2004,第6期

6. Construction of exogenous multiple epitopes of helper T Iymphocytes and DNA immunization of its chimeric plasmid with HBV pre-S2/S gene [J] . Wen-Jun Gao, Xiao-Mou Peng, Dong-Ying Xie, World Journal of Gastroenterology . 2004,第20期

7. Construction of exogenous multiple epitopes of helper T Iymphocytes and DNA immunization of its chimeric plasmid with HBV pre-S2/S gene [J] . Wen-Jun Gao, Xiao-Mou Peng, Dong-Ying Xie, World Journal of Gastroenterology . 2004,第20期

8. Plasmid DNA Transfection using magnetite cationic liposomes for construction of multilayered gene-engineered cell sheet [J] . Ino K, Kawasumi T, Ito A, Biotechnology and Bioengineering . 2008,第1期