染料法支原體污染實時定量PCR試劑盒

Dye-quantitative Real-time PCR Kit for Mycoplasma contamination

貨號：Myco-qs-20，規格：20個反應

貨號：Myco-qs-20，規格：20個反應

貨號：Myco-qs-20，規格：20個反應

儲存：-20度，避光保存，有效期一年。避免反復凍融。

試劑盒特點：

1， 對柔膜菌綱（包括支原體、螺原體和無膽甾原體）有極強的特異性，與柔膜菌綱以外的其他基因組無交叉反應。

2， 靈敏度高，most低可檢出反應液中2-4個基因組。

3， 使用熱啟動的Taq酶，可抑inhibit制非特異性擴增，降低背景熒光。

4， 帶有陽性對照樣品（組分C），可用于檢驗試劑盒有效性，也可用于驗證待測樣品中是否含有PCRYZ劑。

5， 帶有ROX參比染料，幫助校正加樣誤差和管間差異。

支原體(Mycoplasma)屬于柔膜菌（Mollicutes）綱,直徑約0.1-0.3 μm,具有變形能力，因此可以輕易穿過常規的0.22 μm無菌濾膜,是常見的動物細胞培養污染源。由于支原體體積太小，在光學顯微鏡下不可分辨，因此細胞常常在不知不覺中被污染。

目前的經典檢測方法是歐洲藥典（European Pharmacopeia）2.6.7規定的體外培養法，用特殊培養基對支原體進行培養，以此檢測污染情況。培養法的優點是檢測靈敏度高，缺點是耗時較長，most長的需要28天之久，而且受操作人員的技能水平影響較大，不同實驗室的檢測誤差較大。隨著生物制藥業的發展，很多生物制品保質期較短，因此需要一種快速、靈敏并且特異性強的支原體檢測方法。歐洲藥典因此接納了核酸檢測方法作為培養法的替代方案。定量PCR法可以在幾個小時內完成檢測，靈敏度與培養法相當，甚至更好。

本試劑盒以16S rRNA基因為靶點，設計了多對引物，可檢出大部分已知的支原體，以及部分螺原體和無膽甾原體，與親緣關系較近的革蘭氏陽性菌，如鏈球菌、梭菌、乳桿菌等，沒有交叉反應，在檢測范圍和特異性方面達到歐洲藥典的要求。歐洲藥典提及的所有支原體均在本試劑盒的檢測范圍內。靈敏度方面，most低檢測值可以達到每個反應2-4個基因組，在不考慮DNA提取損耗的情況下，達到歐洲藥典要求的10 CFU/mL的most低檢測值。

本試劑盒包含熱啟動Taq酶、dNTP（以UTP代替了TTP）、引物、陽性對照品、SYBR Green I染料、ROX染料，和用以防止殘余DNA污染的UDG（尿嘧啶-N-糖苷酶），用戶只需準備好DNA樣品即可使用。

注意事項：

1，      本產品僅限于科研使用，不作診斷用途。

2，      操作過程中應注意防范樣品之間的串聯污染。建議對工作區域進行劃分，將不同步驟，如DNA提取和PCR反應液的配制，分開在不同階段不同區域進行。使用無污染的一次性槍頭，建議用帶濾芯的槍頭。建議在通風區域操作，操作時須佩戴無粉塵手套。

3，      對于在584 nm附近可產生激發光的儀器（大部分使用鎢燈或鹵素燈作為光源的儀器，還有一些儀器專門配置了LED燈，可激發~584 nm光源），ROX的反應濃度為30-50 nM。對于不能在584 nm附近可產生激發光的儀器（大部分以激光為光源的儀器），ROX的反應濃度為300-500 nM。具體可參考儀器的使用手冊，下表僅供參考。

熱啟動Taq酶結合了特異性單克隆抗體的DNA聚合酶，在室溫下聚合酶活性被抗體YZ。在PCR循環的變性階段，抗體受熱被去除，聚合酶活性恢復，因此獲得“熱啟動”功能，可減少殘余DNA的污染，提高PCR擴增效率、靈敏度和目的片段產量。

SYBR Green I可以與DNA雙鏈的小溝結合，結合后在497nm激發光照射下產生520nm的發射光。未結合雙鏈DNA的SYBR Green I基本不產生熒光。因此可以根據熒光值的大小判斷溶液內DNA雙鏈的多寡，用于實時檢測PCR反應過程中產物的累積量。初始模板濃度越高，反應循環數越高，則雙鏈DNA含量越高，熒光值也就越高。值得注意的是，SYBR Green I也可以結合非特異性PCR產物以及引物二聚體，此時產生的熒光與目標擴增產物無法區分。為了判斷熒光信號是否來自目標擴增產物，可以繪制熔解曲線。通過逐步緩慢升溫，使雙鏈DNA解離為單鏈DNA，同時檢測熒光值的變化，繪制曲線，根據熒光值觀察DNA解鏈的溫度。

UDG和dUTP可以阻止前次步驟殘余DNA的擴增。dUTP可以確保擴增后的DNA中均含有尿嘧啶。UDG可從單鏈或雙鏈DNA上去除尿嘧啶殘基，從而阻止含有尿嘧啶的DNA作為下幾輪PCR的模板。在PCR循環開始前的UDG孵育步驟，可以破壞帶有尿嘧啶的PCR產物。經過該去除污染步驟后，UDG在正常的PCR循環過程中被高溫滅活，對PCR反應沒有影響。

ROX不參與PCR反應，在PCR反應過程中熒光沒有變化，可以提供一條基線用于校正加樣誤差和管間差異，便于儀器自動分析報告熒光與內參ROX熒光的比值，使定量更準確。ROX染料的激發波長為584nm，發射波長為612nm。用ROX進行校正后可以使實驗誤差減小十倍左右。

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