RNA高通量測序（RNA-sequencing,縮寫為RNA-seq）是目前高通量測序技術中應用廣泛的技術之一，它可以幫助我們了解各種比較條件下基因表達情況的差異。在所有差異類型的檢測中，常見的方法為檢測mRNA表達量的差異，而mRNA樣本在上機測序之前會做怎么的處理？它與DNA樣本的建庫處理又有哪些不同？今天小翌跟大家詳細講解。

在上機測序之前，提取到的核酸樣本都需要做處理，樣本處理的過程就叫做建庫，我們都知道DNA建庫的本質是在核酸片段兩端加上接頭的過程，RNA建庫的本質也是如此。RNA建庫由于增加了RNA富集、片段化和反轉成雙鏈DNA幾個步驟顯得比DNA文庫構建要繁瑣些，下面我們一起看看 mRNA建庫中的三個關鍵步驟：mRNA純化、片段化處理和反轉成雙鏈DNA。

首先說到mRNA純化，為什么要做mRNA純化呢，這是因為通常抽提到的總RNA中，絕大部分都是核糖體RNA（rRNA），如圖1所示：

圖1.人類組織或細胞總RNA中各種RNA分布餅狀圖

核糖體RNA占90%以上，mRNA占2%~3%，剩下的為LncRNA、tRNA、miRNA等。

如果我們把所有的RNA都拿來測序，測到的絕大部分的數據都是rRNA，而rRNA在不同組織、器官當中的表達極度穩定，也就是說，這樣的數據，并不能為實驗者提供有用的信息，所以在很多的轉錄組測序實驗中都選擇純化mRNA的方法來提高最終測序數據利用率。

那么，該怎樣從總的RNA中，單獨將我們想要的mRNA純化出來呢 ？

mRNA純化的方法主要包括兩種：poly（A）純化法和去除rRNA法

Poly（A）純化法主要應用在真核生物的mRNA純化，大部分真核生物的mRNA結構與原核生物的mRNA結構有明顯區別，真核生物的mRNA的3’端具有poly（A）尾結構，因此可以選用Oligo（dT）磁珠直接進行靶向雜交富集（見圖2）；當然，也可以通過使用Oligo（dT）引物進行反轉錄以擴增捕獲帶有poly（A）的mRNA，但是引物捕獲由于特異性差和富集度低，因此在實際操作中還是以磁珠純化的方法較多。

圖2. 利用Oligo（dT）磁珠特異性吸附真核生物mRNA示意圖

注意：利用Oligo dT磁珠對mRNA進行富集和純化時，在移除上清時要等磁珠被徹底吸附后（上清澄清）在磁力架上小心進行，避免吸到磁珠，以免造成mRNA的損失。加入片段化試劑前，要將Bead Washing Buffer吸干凈，否則會影響片段化結果，可以在用大規格槍移除液體之后再用10 uL的移液槍移除殘留的Washing Buffer（或者直接用200 uL的黃槍頭套著10 uL的白槍頭使用）。

針對類似原核生物中沒有poly（A）結構的mRNA和部分樣品降解的總RNA樣本（如FFPE樣本），無法直接富集，只能通過去除rRNA的方法來達到富集mRNA的目的。

目前所涉及的去除rRNA方法主要如下：

mRNA純化之后的文庫構建通常有兩種思路，一種是先用oligo（dT）引物反轉錄mRNA，再進行cDNA的片段化，另外一種則是先將mRNA打斷，再結合隨機引物進行反轉錄。

1）先用oligo（dT）引物反轉錄mRNA，再進行cDNA的片段化：此方法先得到長片段的cDNA，反轉成雙鏈cDNA之后再利用DNA片段化的方法進行片段化（酶切法或機械法），得到片段化dsDNA之后的建庫方法與DNA建庫方法完全一致。

2）先將mRNA打斷，再結合隨機引物進行反轉錄：此方法中的mRNA打斷方法包括堿處理法、金屬離子（Mg2+、Zn2+）溶液處理法、酶（RNaseIII）處理法，mRNA片段化之后應立即進行一鏈cDNA合成，因為mRNA在該體系下非常容易降解。選擇金屬離子（Mg2+、Zn2+）溶液處理法打斷時需根據需要的文庫片段大小選擇合適的打斷溫度和時間。（一般設置為150-200bp  94°C，15 min；200-300bp 94°C，10 min；250-550 bp 94°C，5 min）

兩種片段化結果，對后期的轉錄本有不同的偏好性，對應數據可參考下圖：

圖7.不同方法建庫對后期讀數的偏好性，紅線代表RNA片段化，綠線代表反轉為cDNA后片段化

先針對mRNA進行打斷再進行反轉錄獲得測序reads主要是針對基因本體的；若先反轉錄，尤其是結合oligo(dT)進行反轉錄獲得的測reads對轉錄本3'端具有比較強的偏好性，所以在mRNA-Seq中建議采用先對mRNA打斷再進行反轉錄的文庫構建方法。

在做mRNA測序文庫構建的時候，一般分為常規建庫和mRNA鏈特異性建庫。鏈特異性文庫和常規mRNA文庫的區別在于合成第二鏈cDNA時加入的核苷酸種類，如果要構建常規mRNA文庫，則加入dNTP，而如果要構建鏈特異性mRNA文庫則加入dNTP中使用dUTP代替dTTP，這樣合成的第二鏈cDNA含有U堿基，后期再通過識別U堿基的方法去除第二鏈cDNA，從而達到構建鏈特異性mRNA的效果，具體方法包括：使用特殊酶不擴增帶有U堿基的鏈；使用UDG酶去除帶有U堿基的合成鏈。

以上就是小翌為大家解析的mRNA建庫的關鍵步驟，此外，小翌還專程為大家繪制了一幅mRNA建庫的標準流程圖，希望可以幫助大家對建庫的整套流程有更好的認識。

圖9. mRNA建庫流程圖

翌圣生物科技（上海）股份有限公司是一家聚焦生命科學產業鏈上游核心原料，從事分子、蛋白和細胞三大品類生物試劑的研發、生產與銷售的高新技術企業。核心產品覆蓋qPCR系列、NGS系列、逆轉錄系列、核酸提取與純化系列、PCR系列、分子克隆系列、體外轉錄系列、抗體、蛋白純化系列、蛋白分析系列、重組蛋白、細胞分析系列、細胞培養系列、細胞轉染系列、報告基因檢測系列等多個品類，廣泛應用于生命科學研究、診斷檢測和生物醫藥等領域。