在常見單抗工藝上，ADC藥物工藝中還增加連接子-小分子藥物制備、ADC原液制備等工藝，并且偶聯(lián)過程中除了會額外引入有機試劑、偶聯(lián)酶（如適用）、空載連接子、游離有效載荷及其衍生物等雜質外，偶聯(lián)過程也改變了彼此的物理化學特性，可能會引起結構、電荷等變化。因此在ADC偶聯(lián)工藝后還需增加純化工藝，以去除工藝相關雜質與產(chǎn)品相關雜質。

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目前ADC偶聯(lián)后，下游純化工藝普遍多使用切向流過濾 (TFF) 用于去除有機雜質、偶聯(lián)相關雜質或緩沖液的置換。因這些雜質的分子量明顯低于TFF膜包的截留分子量MWCO，所以切向流過濾方法理論上可以去除這些游離小分子雜質，需要注意的是與單抗的UFDF步驟相比，ADC偶聯(lián)后的UFDF往往需要更多DV以確保雜質降至可接受水平。然而對于游離的連接子和有效載荷會有一些挑戰(zhàn)，難點通常在于其可能于ADC藥物和/或UFDF膜之間存在低親和力的非共價相互作用^[2]，但通過額外的UFDF工藝參數(shù)調整或者增加層析步驟來解決相應雜質的去除，研究者篩選了幾種巰基淬滅劑，最后發(fā)現(xiàn)結合混合物通過L-半胱氨酸處理，可以有效增加雜質透過效率（圖1）^[3]。

在其他的一些案例中，游離的藥物和溶劑不能完全被UFDF清除到理想水平，就需要在超濾工藝之后增加層析步驟，可以使用分子篩層析或者陽離子交換層析將其去除。以陽離子層析為例^[4]，調整上樣樣品環(huán)境，ADC與層析柱上帶有負電荷的配基結合，而游離的藥物和溶劑則會流過柱子，不發(fā)生結合，根據(jù)此原理，可以顯著降低小分子雜質的含量，如下圖案例所示，經(jīng)過陽離子層析后，游離藥物含量從上樣樣品的52.2%降至了5%。同理，抗體平臺常用的Capto S Impact與Capto SP ImpRes在ADC藥物偶聯(lián)后純化同樣適用。

抗體通常具有復雜的異質性（如電荷變異體、分子大小變異體、糖基化和其他翻譯后修飾等），裸抗本身的異質性及偶聯(lián)造成的異質性的疊加會導致ADC的復雜程度大幅增加^[1]。在目前ADC偶聯(lián)工藝中，聚集體的出現(xiàn)更為常見，而且聚集體一旦形成，在后續(xù)的純化過程中僅使用UFDF去除掉是比較困難的，因此針對聚集體同樣考慮使用層析純化來達到去除的目的。下圖示例所用純化填料使用SP Sepharose Fast Flow，當樣品上到300 g/l時，vHMWS這種雜質會開始流穿。最終，通過陽離子的流穿模式，將vHMWS的含量降低到了0.03%，平均DAR值未受到影響^[5]。

除了常見的球狀填料，我們還有另外一款膜層析Mustang S可供選擇，膜材是親水性的聚醚砜，孔徑0.65 μm，膜上連接有強陽離子S配基，由16層膜構成，同樣是ADC純化中的有力工具。

DAR表示每個抗體分子上偶聯(lián)的有效載荷的平均數(shù)量，直接與產(chǎn)品的有效性和安全性相關，是ADC產(chǎn)品的關鍵質量屬性。盡管越來越多的ADC平臺采用定點偶連策略實現(xiàn)DAR值的高均一性，但仍可以通過以疏水相互作用層析 (HIC) 工藝實現(xiàn)對DAR值范圍的控制。正如以下案例所示^[6]，在Butyl Sepharose HP層析柱上樣后通過緩沖液由高鹽至低鹽的線性梯度洗脫，未偶聯(lián)載荷的裸抗由于疏水性較弱而最早出峰，其次是DAR2，然后是DAR4，由于DAR6/8的疏水性較強，最后在CIP階段出峰（圖4）。

除以上幾種純化方式外，還有分子篩層析可供選擇，分子篩層析可以在純化過程中同時實現(xiàn)緩沖液置換與小分子和聚集體雜質的去除，但無法解決DAR值分布不均問題，因此，在ADC藥物純化過程中，還需要針對不同的純化目的選擇不同的純化手段。

參考文獻