寡核苷酸藥物合成及其雜質分析

來源：蘇州英賽斯智能科技有限公司分類：應用方案

2024-07-25 16:15:12 75閱讀次數

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寡核苷酸是一種通過固相合成法生產的新興藥物。作為一種化學物質，它們具有獨特的產品相關雜質和降解物，其表征是藥物開發的必要步驟。

近年來由于核酸修飾和遞送載體的突破，帶來了變革性療法的創新浪潮，其中被認為是繼小分子藥物、抗體藥物之后第三代創新藥物的核酸藥物迎來了爆發式增長，其優勢在于廣泛的可成藥靶點、特異性強、安全性高、效果持久、開發成功率高和制造成本低等。

寡核酸藥物是由20-60個核苷酸單元組成的單鏈或雙鏈結構，通過作用于mRNA來調控疾病基因轉錄翻譯，抑制基因表達，主要有反義寡核苷酸（ASOs)，小干擾RNA（siRNA）和微小RNA（miRNA）。

寡核苷酸的固相合成

基于固相亞磷酰胺化學法，該方法通過將核酸固定在固相載體上，通過脫保護、偶聯、氧化和加帽四步循環，每個循環連接上一個新的核苷酸，直至寡核苷酸鏈延伸至所需長度。具體步驟如下：

脫保護

使用溶解在二氯甲烷/甲苯中的2-3%三氯乙酸（TCA）或二氯乙酸（DCA）移除核糖5'的DMT基團，暴露5'-OH，以供下一步偶聯。

偶聯

將亞磷酰胺保護的核苷酸單體與四氮唑活化劑混合并進入合成柱，形成亞磷酰胺四唑活性中間體。亞磷酰胺四唑活性中間體遇到載體上已脫保護基的核苷酸時，將與其5'-羥基發生親核反應，縮合并脫去四唑，此時合成的寡核苷酸鏈向前延長一個堿基。

氧化/硫代

偶聯反應時核苷酸單體是通過亞磷酯鍵（磷為三價）與連在載體上的寡核苷酸連接，而亞磷酯鍵不穩定，易被酸、堿水解。因此需要被氧化劑氧化成穩定的五價的磷。

加帽

偶聯反應后為了防止連在載體上的未參與反應的5'-OH在隨后的循環反應中被延伸，通常使用兩種試劑（蓋帽劑A：醋酸酐和蓋帽劑B：N-甲基咪唑，酰化反應的催化劑）來酰化5'-OH。

經過以上四個步驟后，一個脫氧核苷酸被連接到固相載體的核苷酸上。

寡核苷酸固相合成中雜質

在寡核苷酸的固相合成過程中，產生的雜質種類多樣，包括寡聚物（短核苷酸N-x/長核苷酸N+x）、修飾反應的副產物、脫保護基不完全產物、缺失嘌呤堿基的寡核苷酸以及其他降解產物等。下文對各步驟可能產生雜質做簡單介紹。

去甲基化

DCA溶液，在二氯甲烷或甲苯中，可能含有微量三氯乙醛（氯醛）。三氯乙醛與寡核苷酸的末端游離羥基反應形成半縮醛，與新加入的單體反應，生成質量比全長產物（FLP）高147Da的寡核苷酸雜質。

↑二氯乙酸中存在的氯醛在脫甲基化過程中發生反應形成比全長產物（FLP）高147Da的雜質。

脫保護時間取決于流速和柱子尺寸，反應時間不夠/脫保護劑酸性太弱會產生N-1雜質

反應時間太長/脫保護劑酸性太強則導致脫嘌呤的產生。

↑在酸性條件下進行去嘌呤化的機理

偶聯

活化劑四唑提供一個質子給亞磷酰胺單體3'磷酸上二異丙胺基上的氮原子，質子化的二異丙胺是一個良好的離去基團，與四唑形成亞磷酰胺四唑。N-1雜質是偶聯中最常見的雜質，它們的偶聯效率低于100%。N+1雜質的形成由于活化劑四唑的弱酸性能移除一部分亞磷酰胺單體的DMT基團。新加入的亞磷酰胺單體自身形成二聚體，隨后與脫保護的5'-OH反應可能導致N+1雜質產生；新加入的亞磷酰胺單體被偶聯兩次也會導致N+1雜質產生。

氧化/硫代

不完全氧化/硫化會導致兩種DMTr-磷酸鹽雜質，在隨后的脫甲基化過程中產生的DMTr陽離子可以與亞磷酸鹽三酯中間體反應，形成含有對酸穩定的DMTr基團的寡核苷酸。一種雜質比N-1多366Da，另外一種雜質比FLP多286Da。另外，氧化試劑可以將已形成的PS鍵氧化為PO鍵，得到比FLP少16Da的雜質。