顯微課堂 | 高壓冷凍技術如何提升海洋微生物分析效果
甲藻的超微結構分析
環境樣本（此處以甲藻為例）的超微結構分析至今仍具挑戰性。本研究證明，現場實施高壓冷凍（HPF）技術能顯著保存細胞超微結構，為后續電子顯微鏡（EM）分析提供條件，從而獲得關于這些海洋生物的新認知。
浮游生物分析材料與方法
甲藻采集采用 5 或 10 微米孔徑網具在法國濱海自由城灣表層水域慢速拖網 10 分鐘。甲板收集后，樣品經 Retsch 系列篩網過濾獲取 40 微米以下細胞。實驗室處理流程為：
1
通過手動泵抽濾在 1.2 微米混合纖維素酯膜（Merck）上濃縮；
2
重懸至終體積約 4 毫升；
3
1000g 離心 5 分鐘。棄上清后，取約 1.2 微升沉淀物裝入預先涂覆十六烯（Merck）的金銅 A 型載樣臺（Leica；深 200 微米，寬 3 毫米），覆蓋同樣預涂十六烯（Merck）的鋁制 B 型載樣臺（Leica）平面端，使用 Leica EM ICE 進行高壓冷凍。
圖 1：高壓冷凍載樣臺中的濃縮細胞裝載示意圖
圖 2：A型金載樣臺（寬 3 毫米，使用面深度為 200 微米）與B型載樣臺（寬 3 毫米，使用平面側）。
冷凍固定樣本經過冷凍置換處理（使用 EM AFS2 型號，Leica 公司），程序及溶液如下：在-90°C 的 2%四氧化鋨丙酮溶液中保持 60 小時，以 2°C/小時的速率升溫 15 小時至-60°C，于-60°C 維持 10 小時，再以相同速率升溫 15 小時至-30°C，保持 10 小時后，以最大速率 1 分鐘內升溫至 0°C，停留 1 小時，隨后以最大速率 1 分鐘內冷卻回-30°C，并用純丙酮在-30°C 下洗滌 5 次。
細胞隨后逐步滲透 EPON 硬樹脂。采用的樹脂（不含促進劑）/丙酮（體積比）梯度系列為：25%濃度起始于-30°C，2 小時內升溫至-10°C；50%濃度起始于-10°C，以 5°C/小時速率升溫 2 小時至+10°C；75%濃度起始于+10°C，以 10°C/小時速率升溫 2 小時至+20°C。樣本隨后在不含促進劑的 100%樹脂中分兩次滲透，分別為 12 小時和 48 小時。
隨后用含促進劑的 100%樹脂進行兩次 3 小時和一次過夜的滲透處理，之后在 60°C 下聚合 48 小時。使用超薄切片機（Leica EM UC7）搭配超薄金剛石刀（Diatome）切制 70 納米薄片。薄片經 1%醋酸鈾水溶液染色 20 分鐘和檸檬酸鉛染色 3 分鐘后進行后染色。通過 SerialEM 軟件在 JEOL JEM 2100plus 電鏡上以 120 千伏電壓和 8000 倍放大倍數采集拼圖影像。拼圖處理采用 Imod 和 Fiji 軟件完成。高壓冷凍樣本處理由海德堡 EMBL 電子核心顯微設施（EMCF）完成。
結果
圖 3：按上述方法處理的甲藻顯微照片。比例尺=1 μm。
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