樣本的大小以及適用的觀察技術(shù)。

該技術(shù)涉及樣本的制備，樣本在電子顯微鏡載網(wǎng)上，然后迅速陷入液氮中冷凍，使樣本玻璃化，防止冰晶形成。

為了進(jìn)行高分辨率的冷凍斷層掃描，成像的標(biāo)本切片厚度不應(yīng)大于300納米。為了觀察樣本的“較厚”部分（如細(xì)胞體），必須將樣本減薄。除了冷凍超薄切片技術(shù)外，使用專門或多模態(tài)的冷凍掃描電子顯微鏡進(jìn)行聚焦離子束(FIB)研磨是一種首選方法。兩個離子束窗口的定位應(yīng)確保在感興趣區(qū)域內(nèi)形成厚度大約200納米的薄冰片（薄片），以便進(jìn)行冷凍電鏡電子斷層掃描。

現(xiàn)在可以用冷凍透射電子顯微鏡掃描制備的樣本，然后必須進(jìn)行數(shù)據(jù)重建過程，將二維圖像重建為單一的三維模型。

Coral Cryo 3D冷凍電子斷層掃描工作流程解決方案

LAS X Coral Cryo：基于插值的三維目標(biāo)定位，在x和y方向?qū)η衅M(jìn)行多層掃描(z-stack)。這些標(biāo)記可在所有相關(guān)窗口中交互式移動。

冷凍光學(xué)顯微鏡可以在兩個重要方面對CryoET工作流程做出積極貢獻(xiàn)。

首先，光學(xué)顯微鏡有助于評估樣本的質(zhì)量。使用冷凍光學(xué)顯微鏡可以快速了解樣本的冷凍質(zhì)量和冰層厚度，以及樣本的分布是否適合進(jìn)一步處理。徠卡的冷凍解決方案可確保樣本在這些步驟中保持安全和活性。

其次，在提高工作流程效率方面，冷凍光學(xué)顯微鏡的最大潛力是能夠在啟動時間和成本密集型的冷凍電鏡制備工作之前，更加精準(zhǔn)地定位感興趣的結(jié)構(gòu)。徠卡的冷凍光學(xué)顯微鏡解決方案能夠?qū)⒛繕?biāo)結(jié)構(gòu)的圖像和坐標(biāo)輸出到后續(xù)的電鏡步驟，從而顯著縮短電鏡成像時間。

一個完整載網(wǎng)的焦面總覽，有不同的模式來識別載網(wǎng)缺陷、對齊標(biāo)志和目標(biāo)分布。HeLa細(xì)胞由德國海德堡歐洲分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室Mahamid團(tuán)隊的Ievgeniia Zagoriy提供。藍(lán)色–Hoechst，細(xì)胞核；綠色–MitoTracker Green，線粒體；紅色–Crimson熒光珠和Bodipy，脂滴。一個載網(wǎng)方格的邊緣長度：90微米，比例尺寬度：35微米。完整載網(wǎng)直徑：3毫米

萊茵衣藻，兩種不同類型的鞭毛內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白IFT-NeonGreen和IFT-mCherry。樣本由德國德累斯頓馬克斯-普朗克分子細(xì)胞生物學(xué)與遺傳學(xué)研究所的Pigino實(shí)驗(yàn)室提供。

了解無縫銜接的冷凍電子斷層掃描工作流程Coral Cryo如何使用共聚焦超分辨率更精準(zhǔn)定位您感興趣的結(jié)構(gòu)。該工作流程可減少并優(yōu)化工作流程的步驟，改善樣本的裝載和傳送，因此可提高CryoET工作流程的效率。

頂部掃描電鏡視圖（左圖）和聚焦離子束視圖（右圖）的超分辨率三維共聚焦疊加圖像。疊加是使用熒光珠作為相關(guān)性標(biāo)志來執(zhí)行的。HeLa細(xì)胞標(biāo)記如下：細(xì)胞核由Hoechst標(biāo)記，藍(lán)色；線粒體由MitoTracker Green標(biāo)記，綠色；脂滴由Bodipy和Crimson熒光珠標(biāo)記，紅色）。比例尺：20微米。細(xì)胞由德國海德堡歐洲分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室Mahamid團(tuán)隊的Ievgeniia Zagoriy提供，掃描電鏡/聚焦離子束圖像由該團(tuán)隊的Herman Fung提供。

STELLARIS 5 Cryo 冷凍共聚焦光學(xué)顯微鏡