顯微課堂 | 高壓冷凍簡介
水是細(xì)胞最主要的組成部分,因此對于維持細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)至關(guān)重要。目前,冷凍固定是固定細(xì)胞成分,而不導(dǎo)致其顯著結(jié)構(gòu)變化的唯一途徑。現(xiàn)階段有兩種常見的方法:投入冷凍與高壓冷凍固定。
冷凍固定相較于化學(xué)固定有兩個明顯的優(yōu)點(diǎn)。它能在毫秒量級內(nèi)完成固定,并確保同時固定所有的大分子組分。多數(shù)蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)非常不穩(wěn)定,滲透環(huán)境或溫度的略微變化就會導(dǎo)致其發(fā)生崩解。冷凍固定能夠盡可能減少這些不良影響,以便更好地保存生物樣品的超微結(jié)構(gòu),促進(jìn)對動態(tài)過程的研究。目前,高壓冷凍是獲得較厚玻璃化樣品(高達(dá)200 μm)的唯一方法。
圖1:生長在藍(lán)寶石片上的小鼠胚胎纖維原細(xì)胞(由英國布里斯托大學(xué),Verkade P提供)。
介紹
成功的冷凍固定即玻璃化,是將水從液態(tài)轉(zhuǎn)化為非晶態(tài),而不產(chǎn)生冰晶。冰晶成核與溫度和壓力有關(guān)(請參見以下圖表)。該過程與冷卻速率相關(guān),因此冷凍固定是一個時間依賴性過程。冷卻速率取決于水的熱力學(xué)性質(zhì)、樣品厚度以及樣品表面的熱量流失速率。
Moor和Riehle[1]首先提出了高壓冷凍生物樣品的構(gòu)想。于1985年,高壓冷凍裝置成功商品化。盡管目前高壓冷凍儀設(shè)計各不相同,但都能以在20 ms內(nèi)對樣品進(jìn)行同步加壓與冷卻,并具有很高的重復(fù)率。
圖2:Kanno等人[2]繪制了水的狀態(tài)與壓力和溫度的關(guān)系曲線。曲線顯示在2,045 bar的壓力下,水的熔點(diǎn)降低到251 K,且均相成核的溫度降低到181 K。
高壓冷凍的新維度
基于Leunissen和Yi[3]發(fā)現(xiàn)的自增壓快速冷凍原理,開發(fā)了一種新技術(shù)。該技術(shù)利用密封樣品載具內(nèi),液體水在冷卻過程中的膨脹趨勢,從而在內(nèi)部產(chǎn)生壓力,因而無須使用外部增壓系統(tǒng)。這種壓力能夠在密封樣品載體內(nèi)形成透明且低密度冰。為了達(dá)到所需壓力(2,010 bar),使冰的熔點(diǎn)降低到251 K(Kanno等人[2]),樣品載具內(nèi)60%的水須轉(zhuǎn)化為低密度冰。
以物理學(xué)的視角觀察
相較于液態(tài)水,低密度冰的形成會導(dǎo)致體積膨脹。數(shù)值模擬表明,凍結(jié)過程從載體壁向中心發(fā)展,該過程會產(chǎn)生強(qiáng)烈彎曲冰鋒。制冷劑浸透速度越高,該效應(yīng)就愈加顯著。當(dāng)冰鋒最平坦時,含有低密度冰的部分和充分冷凍或玻璃態(tài)的部分之間分離地最好。這可以通過在徠卡EM SPF程序界面內(nèi),根據(jù)不同樣品調(diào)整凍結(jié)參數(shù)來實(shí)現(xiàn)。在制冷劑浸透過程中,管內(nèi)的冰鋒始終在致冷劑表面以上,該冰鋒的距離取決于浸透速度。
應(yīng)用——光鏡-電鏡關(guān)聯(lián)(CLEM)
圖3:生長在藍(lán)寶石片上的PtK2細(xì)胞的光鏡圖像:將定位網(wǎng)格固定于細(xì)胞上方附近,用于追蹤樣品。
圖4:DIC與熒光圖像:當(dāng)定位到感興趣細(xì)胞時,拍攝DIC與熒光圖像(內(nèi)化EGF-QD655)。疊加圖像(右圖)顯示了細(xì)胞中含有EGF-QD655結(jié)構(gòu)的位置。方框區(qū)域?yàn)榧?xì)胞內(nèi)的感興趣區(qū)域。
–15 s
–10 s
–5 s
0 s
圖5:感興趣細(xì)胞內(nèi)的熒光量子點(diǎn):實(shí)時跟蹤感興趣細(xì)胞內(nèi)包含熒光量子點(diǎn)的結(jié)構(gòu),每秒一幀拍攝圖像。此處展示了該電影序列中相隔5秒的靜止畫面。最后一張圖像也是該序列的最后一張(因此時間為0秒)。此時,將快速裝載器從光鏡載物臺插入到RTS中,并冷凍樣品。
圖6:感興趣細(xì)胞的電子顯微鏡圖像(左),放大圖(右):右側(cè)電鏡圖像為左側(cè)感興趣細(xì)胞中方框區(qū)域的放大圖。箭頭指示在結(jié)構(gòu)內(nèi)部的量子點(diǎn)。將左圖中的“C形”結(jié)構(gòu)與圖3的最后一張圖像進(jìn)行比較,可以觀察到相似的“C形”結(jié)構(gòu)。這里需要注意的是,電鏡圖像樣品厚度為70 nm,而熒光圖像則約為1 μm厚。由英國布里斯托大學(xué)的Verkade P提供。相關(guān)儀器:Leica EM PACT2和Leica EM RTS
應(yīng)用——冷凍電子顯微鏡玻璃化切片(CEMOVIS)
切片樣品是用Leica HPM100,在銅管中冷凍的酵母細(xì)胞制備的。將細(xì)胞團(tuán)與pH 6.5 MES/葡聚糖緩沖液混合,使得最終 MES 濃度為50 mM,葡聚糖濃度為20%。
樣品在配置有微操作器的Leica EM UC7/EM FC7冷凍超薄切片機(jī)上,在-140℃下,制備50 nm厚切片,并將切片收集于瓊脂膜載網(wǎng)上。
使用配有4 K Gatan CCD照相機(jī)的Tecnai Polara 300KeV(荷蘭FEI公司)電子透射顯微鏡對切片成像。圖像放大倍率為23 K,在成像時,采用6 um的散焦距離拍攝斷層圖像和8 um的散焦距離拍攝投影圖像,并采用930 mm的相機(jī)長度拍攝衍射圖像。左側(cè)的圖像是用IMOD軟件包(Kremer等人 [4])的圖像處理軟件,對FEI軟件采集的10張斷層圖像進(jìn)行重構(gòu)的結(jié)果。
圖7:左側(cè)為斷層重構(gòu)的圖像。右上為玻璃化酵母細(xì)胞的電鏡照片。右下為衍射圖像。由倫敦大學(xué)伯貝克學(xué)院晶體學(xué)系的O'Driscoll J、Clare DK和Saibil H制備。相關(guān)儀器:Leica EM HPM100
應(yīng)用——冷凍斷裂和冷凍替代
圖8:錐體神經(jīng)元細(xì)胞:錐體神經(jīng)元突觸聯(lián)接一個神經(jīng)末梢(P面)和一個樹突棘(E面)。由德國弗萊堡大學(xué)解剖和細(xì)胞生物學(xué)研究所的Kulik A提供;相關(guān)儀器:Leica EM HPM100。
圖9:圖1中細(xì)胞包涵體的高倍放大圖。(C)肺炎衣原體細(xì)胞;(G)糖原顆粒;(Go)高爾基體;(M)線粒體;(Mt)微管;(R)核糖體;(V)囊泡。比例尺為500 nm。由瑞士蘇黎世大學(xué)顯微鏡與圖像分析中心的Kaech A提供;相關(guān)儀器:Leica EM HPM100。
應(yīng)用——SPF
圖10:釀酒酵母菌的CEMOVIS圖像。由波恩德國神經(jīng)退行性疾病研究中心(DZNE)的Al-Amaudi A提供;相關(guān)儀器:Leica EM SPF。
圖11:假單胞菌的冷凍替代圖像。由巴塞羅那大學(xué)科學(xué)與技術(shù)中心——巴塞羅那科技園的Lopez-Iglesias C、Delagado L和Mercade E提供;相關(guān)儀器:Leica EM SPF。
圖12:秀麗隱桿線蟲的冷凍替代圖像。由特拉華生物技術(shù)研究所生物成像中心(Modla S、Jacobs S、Caplan J和Czymmek K)和賓夕法尼亞大學(xué)(Tanis J)提供。
圖13:多邊舌甲藻的冷凍替代圖像(外泌體)。由斯圖加特功能基因組學(xué)實(shí)驗(yàn)室的Lindemann E和Fraunhofer IG B提供;相關(guān)儀器:Leica EM SPF。
相關(guān)產(chǎn)品
EM ICE高壓冷凍儀
徠卡顯微咨詢電話:400-630-7761
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