科研人必知！Raw264.7炎癥模型構建的黃金法則 | 上海富衡
構建RAW264.7細胞炎癥模型是研究巨噬細胞介導的炎癥反應及相關藥物篩選的常用方法。
以下是詳細的實驗步驟和注意事項：
一、實驗材料
細胞系：小鼠單核巨噬細胞系RAW264.7（需確認細胞狀態良好，無污染）。
刺激劑：
脂多糖（LPS等炎癥刺激因子，常用濃度0.1-1 μg/mL）。
其他可選刺激劑：PMA（佛波酯）、IFN-γ（干擾素γ）、TNF-α等。一般可與LPS聯合使用，提高炎癥反應。
培養基：DMEM高糖培養基 + 10%胎牛血清（FBS） + 1%雙抗（青霉素/鏈霉素）。
檢測試劑：
ELISA試劑盒（檢測TNF-α、IL-6、IL-1β等炎癥因子）。
實時熒光定量PCR（qPCR）試劑（檢測炎癥相關基因如iNOS、COX-2）。
Western blot試劑（檢測NF-κB、MAPK信號通路蛋白）。
活性檢測試劑（CCK-8、MTT或LDH）。
二、實驗步驟
細胞培養
復蘇與傳代：
復蘇后培養至第3代以上，確保細胞狀態穩定。
鋪板（以12孔板為例）：
以12孔板為例，制備2~5×105 cells/mL的細胞懸液，每孔接種500μL，貼壁過夜（12-16小時）。
炎癥模型誘導
刺激劑處理：
A、炎癥刺激因子（LSP等）處理：用含炎癥刺激因子（LSP等）的培養基替換原培養基（常用濃度0.1-1 μg/mL，作用時間12-48小時）。
B、其他刺激劑：如IFN-γ（10-50 ng/mL）聯合LPS可增強炎癥反應。
對照組設置：
A、陰性對照：正常培養基（無刺激劑）。
B、陽性對照：已知有效的炎癥誘導劑（如LPS標準濃度）。（可選）
檢測炎癥反應
炎癥因子檢測（可選）：
ELISA：收集細胞上清液，檢測TNF-α、IL-6等分泌水平。
qPCR：提取細胞RNA，檢測炎癥基因（如TNF-α、IL-1β、iNOS）的mRNA表達。
信號通路分析：
Western blot：檢測NF-κB p65核轉位、IκBα降解，或MAPK通路磷酸化。
細胞活性檢測：
使用CCK-8或MTT評估刺激劑對細胞存活率的影響，排除細胞毒性干擾。
炎癥模型構建效果展示（ELISA法）
三、關鍵注意事項
細胞狀態：
避免細胞過度融合（>90%），高密度可能自發分泌炎癥因子。
傳代時輕柔操作，減少機械刺激導致的異常激活。
刺激條件優化：
預實驗確定最佳炎癥刺激因子濃度和時間（不同批次LPS活性可能差異較大）。
若使用炎癥刺激因子聯合其他刺激劑（如IFN-γ），需優化配比。
無菌操作：
炎癥刺激因子LPS易吸附于塑料表面，建議LPS溶液的保存使用低吸附管。
四、常見問題與解決方案
炎癥因子分泌量低：
檢查炎癥刺激因子活性（更換批次或提高濃度）。
延長刺激時間（如48小時）。
細胞毒性明顯：
降低炎癥刺激因子濃度或縮短處理時間。
更換刺激劑（如改用低毒性的TLR2激動劑Pam3CSK4）。
背景信號高：
確保培養基無內毒素污染（使用專用無內毒素血清和試劑）。
通過以上步驟，可成功構建RAW264.7細胞炎癥模型，用于研究炎癥機制或抗炎藥物的作用。根據課題需求，可選擇合適的檢測方法全面評估炎癥反應。
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